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Danser é um arbusto medicinal amplamente utilizado nos sistemas tradicionais e modernos de medicamentos.É uma planta hemiparasitária perene, de difícil propagação artificial devido à sua baixa taxa parasitária.O parasitismo bem-sucedido de plantas parasitas é fundir seus tecidos e conectar sua vasculatura à vasculatura hospedeira, construindo uma ponte fisiológica, que pode retirar eficientemente água, açúcares e nutrientes de suas plantas hospedeiras.É relatado que os fungos endofíticos desempenham um papel importante na degradação e fusão da parede celular, que é o principal processo de formação da ponte fisiológica.Portanto, neste estudo, os fungos endofíticos de T. chinensis de diferentes hospedeiros foram isolados e, em seguida, os organismos que poderiam degradar os principais componentes das paredes celulares foram triados usando um meio composto por guaihuol e capacidade de degradação de celulose.Os resultados mostraram que cinco cepas foram selecionadas de 72 fungos endofíticos de T. chinensis que apresentam alta atividade enzimática para degradação lignocelulósica.As atividades de lacase e celulase de cinco cepas atingiram seus picos no dia 7, e as maiores atividades enzimáticas dessas duas enzimas foram encontradas na cepa P6, que foi de 117,66 e 1,66 U/mL, respectivamente.A peroxidase de manganês da cepa 4 e a lignina peroxidase da cepa N6 também atingiram seus picos no dia 7 e foram os mais altos entre as 5 cepas, com atividades enzimáticas de 11,61 e 6,64 U/mL, respectivamente.As linhagens 4, 15, 31, N6 e P6 foram identificadas como Colletotrichum sp., Nigerrospora sphaerica, Exserohilum sp., Diaporthe phaseolorum e Pestalotiopsis sp., respectivamente, de acordo com suas propriedades morfológicas e de biologia molecular.Os fungos endofíticos podem secretar enzimas eficientes de degradação da parede celular, que promovem a dissolução e relaxamento da parede celular entre T. chinensis e hospedeiro, contribuindo assim para o parasitismo de T. chinensis.Taxillus chinensis (DC.) Danser pertencente à família Loranthaceae é distribuído principalmente nas áreas sul e sudoeste da China.Os caules e galhos secos com folhas de T. chinensis são ingredientes comumente usados ​​na medicina tradicional chinesa e são chamados de “Sang Ji Sheng” na China.T. chinensis tem um alto valor medicinal.É usado para alívio de condições reumáticas, reforço do fígado e rins, fortalecimento de tendões e ossos e prevenção de abortos1.T. chinensis é uma planta hemiparasitária com diversos hospedeiros2.Enquanto isso, o T. chinensis também é usado como matéria-prima para fazer chá de parasitismo na China, que é um chá de saúde alimentar tradicional chinês e é exportado para cerca de 30 países do Sudeste Asiático3.Portanto, a demanda de T. chinensis está em constante aumento no mercado global de ervas devido ao seu imenso potencial terapêutico.No entanto, o T. chinensis é derivado principalmente de recursos silvestres, que não podem atender plenamente à crescente demanda do mercado.O cultivo artificial de T. chinensis é uma medida eficaz para equilibrar a oferta e a demanda do mercado.No entanto, T. chinensis é uma planta hemiparasitária perene, de difícil propagação artificial devido à sua baixa taxa parasitária.Um componente essencial do sucesso parasitário em plantas parasitas é a capacidade de fundir suas paredes celulares hospedeiras e conectar sua vasculatura por um órgão especializado conhecido como haustório, formando assim uma ponte fisiológica4,5,6,7.Isso permite a transferência não apenas de água e nutrientes para o parasita, mas também de macromoléculas, incluindo mRNAs8 e proteínas9.Assim, a parede celular do hospedeiro é a primeira barreira para a formação de uma ponte fisiológica.Curiosamente, estudos descobriram que a penetração do haustório não causa danos significativos às células da planta hospedeira.Por exemplo, o haustório de Striga hermonthica não causa danos às células da endoderme da planta hospedeira durante a penetração10,11,12.Isso pode ser alcançado de diferentes maneiras.Na maioria das plantas parasitas da família Orobanchaceae, um grande número de enzimas relacionadas à degradação da parede celular tem sido encontrado no processo parasitário12,13.Por exemplo, a pectina metil esterase, que pode degradar a pectina, é encontrada nos locais de punção do hastorium de Oroanche cumana Wallr.e Phelipanche aegyptiaca Pers.14.Outros modificadores da parede celular, como dilatases e enzimas com atividade de transglucanase, mostraram atingir o pico durante o período de penetração da infecção de WM-xilglucano.Em contraste, a inibição desses modificadores de WM-xilglucano reduziu a chance de invasão bem-sucedida do dodder15.Portanto, enzimas relacionadas à degradação da parede celular desempenham um papel importante durante o processo parasitário.No entanto, a origem dessas enzimas não foi mais explorada.T. chinensis é uma planta hemiparasitária com diversos hospedeiros2, nossos trabalhos anteriores descobriram que T. chinensis de diferentes hospedeiros possui ricos recursos de fungos endofíticos.Relatou-se que fungos endofíticos desempenham um papel importante na infecção da planta hospedeira e nas estratégias de colonização.Muitos estudos também mostraram que fungos endofíticos possuem forte capacidade de produzir enzimas relacionadas à degradação da parede celular16,17.Por exemplo, os fungos endofíticos que foram relatados como produtores de xilanase incluem Alternaria alternata18, Hymenoscyphus ericae19 e Aspergillus terreus20.De Almeida et al.21 selecionaram cepas da espécie Acremonium endofítica para produção de hemicelulases e celulases.Suto et al.22 isolaram 155 cepas de fungos produtores de xilanases.Harnpicharnchai et al.23 purificaram uma β-glicosidase termotolerante de um endofítico Periconia sp.de 14 espécies de plantas.Robl et al.16 isolaram 110 linhagens de fungos endofíticos que produziam hemicelulases e enzimas relacionadas.Outros estudos envolveram a seleção de novos isolados utilizando enzimas extracelulares como parâmetros de seleção para promoção do crescimento vegetal.Assim, Silva et al.24 investigaram fungos isolados de Annona spp., enquanto Luz et al.25 empregaram isolados de Passiflora edulis.O estudo de Queiroz et al.26 verificou que em relação às CAZymes nos secretomas dos fungos analisados, as famílias CAZym mais abundantes foram a glicosil hidrolase e as serina proteases.E este estudo demonstra que os secretomas de fungos endofíticos e não endofíticos compartilham um arsenal de proteínas importantes no processo de infecção e colonização de plantas hospedeiras.Além disso, Jaklitsch et al.27 realizaram uma análise filogenética das enzimas ativas de carboidratos que degradam a parede celular de plantas e proteínas auxiliares codificadas nos genomas de nove espécies de Trichoderma que são membros de três grandes clades infragenéricos mais doze outros fungos Hypocreales.Druzhinina et al.28 investigaram a evolução de proteínas necessárias para a degradação da parede celular de plantas em nove genomas de Trichoderma e encontraram um número sem precedentes de eventos de transferência lateral de genes (LGT) para genes que codificam essas enzimas.É bem conhecido que os principais componentes das paredes celulares das plantas são a lignina e a celulose.O papel dos fungos na degradação dessas substâncias tem sido amplamente divulgado, mas esses relatos têm sido focados principalmente em alguns tipos de fungos da podridão da madeira, como o fungo da podridão branca Phanerochaete chrysosporium Burds, Ceriporiopsis subvermispora (Pila T) Gilb.& Ryvarden, e o fungo da podridão parda Postia placenta (Fr.) MJ Larsen & Lombard, etc29,30,31.Os fungos da podridão branca são considerados os mais eficazes e são os principais microrganismos para a degradação da lignina.Os fungos da podridão branca formaram um sistema de degradação único no processo de evolução biológica de longo prazo.Lacase, manganês peroxidase e lignina peroxidase constituem conjuntamente o sistema enzimático de degradação da lignina dos fungos da podridão branca32, podendo degradar todos os componentes da parede celular vegetal, incluindo lignina, celulose e hemiceluloses33,34.Atualmente, pouco se sabe sobre o mecanismo de fungos endofíticos na degradação da parede celular vegetal, mas o papel dos fungos da podridão da madeira na degradação da lignina fornece uma referência para estudar o mecanismo parasitário de T. chinensis sob a perspectiva dos fungos endofíticos.Esse método mostrou que as linhagens de fungos da podridão branca apresentaram a maior capacidade de degradação de lignina e celulose35,36,37.No presente estudo, isolamos fungos endofíticos de raízes haustoriais de diferentes hospedeiros, essas linhagens foram selecionadas para determinação qualitativa das atividades enzimáticas de lacase, lignina peroxidase, manganês peroxidase e celulase.Explorar o mecanismo dos fungos endofíticos de T. chinensis na degradação da parede celular durante o processo parasitário não apenas fornece orientação prática e base teórica para a propagação de T. chinensis, mas também pode fornecer novas ideias de pesquisa para os mecanismos parasitários de outros plantas parasitas, como Cuscuta chinensis, Striga asiatica, Cistanche deserticola.Um total de 147 cepas foram isoladas de T. chinensis (DC.) Danser composta por sete espécies hospedeiras.Estas foram 32 cepas de Morus alba L., 17 cepas de Prunus salicina Lindl., 12 cepas de Diospyros kaki Thunb., 26 cepas de Dimocarpus longan Lour., 10 cepas de Phellodendron chinense Schneid., 27 cepas de Dalbergia odorifera T.Chen e 23 cepas de Bauhinia purpurea Linn.. Um total de 72 cepas de diferentes tipos morfológicos foram selecionados e as atividades da enzima degradante da lignina e da celulase foram avaliadas por meio das placas.Os microrganismos que produziram círculo cromogênico no meio seletivo com guaiacol como indicador tiveram a capacidade de degradar a lignina, e as hifas das cepas produtoras de lacase crescendo no meio produziram uma coloração marrom avermelhada óbvia.72 cepas foram cultivadas em placas de meio seletivo de guaiacol por 11 dias, e a descoloração de cada placa foi observada e registrada nos dias 3, 5, 7, 9 e 11. Os resultados mostraram que 11 cepas não apresentavam círculo de colônias nem círculos cromogênicos.17 estirpes tinham a razão entre o diâmetro do círculo da colónia e o diâmetro do círculo cromogénico inferior a 1. Havia 26 estirpes com a razão entre o diâmetro da colónia e o diâmetro do cromógrafo superior a 1. Havia 7 estirpes com círculos cromogénicos mas sem círculos da colónia.Havia 11 cepas com colônias, mas sem círculos cromogênicos.De acordo com a referência38, pesquisas mostram que a razão entre o diâmetro do círculo da colônia e o cromóforo pode ser usada para julgar se as bactérias podem degradar seletivamente a lignina.Se a proporção for menor que 1, as bactérias podem degradar seletivamente a lignina.Em resumo, após triagem preliminar qualitativa e nova triagem pelo método guaiacol, um total de 5 cepas com círculos cromogênicos grandes e óbvios foram selecionados de 24 cepas fúngicas (cepas fúngicas com uma razão entre o diâmetro do círculo da colônia e o diâmetro do círculo cromogênico de menos que 1 e cepas com círculos cromogênicos, mas sem colônias) para testes subsequentes de atividade enzimática (Tabela 1).Pode-se observar na Tabela 1 que as colônias e círculos cromogênicos dessas 5 plantas também aumentaram com o período de tempo de crescimento, e nenhuma delas aumentou até o dia 11. A Figura 1 mostra o crescimento das cinco cepas na placa colorida de PDA após dia 7.Diagramas de crescimento de diferentes cepas na placa de cor PDA no 7º dia.Nota: 4 representa Colletotrichum acutatum;15 representa Nigrospora sphaerica;31 representa Exserohilum rostratum;N6 representa Diaporthe phaseolorum;P6 representa Pestalotiopsis arceuthobii.Com relação à cultura de placa de meio sólido de celulose de 72 cepas no dia 11, a inspeção das placas nos dias 3, 5, 7, 9 e 11 mostrou que 14 cepas não tinham círculos de colônias transparentes.A razão entre o diâmetro da colônia e o diâmetro do círculo transparente foi inferior a 1 em 58 cepas.As outras cepas tinham a razão de diâmetro livre de colônia para diâmetro transparente maior que 1. Da mesma forma, cepas com a mesma enzima degradante de lignina foram selecionadas a partir de cepas com a razão entre o diâmetro do círculo da colônia e o diâmetro do círculo transparente menor que 1 para teste de atividade enzimática subsequente (Mesa 2).Como pode ser visto na Tabela 2, essas 5 cepas cresceram gradualmente com o tempo e permaneceram inalteradas até 9 dias, mantendo a faixa de valor original.A Figura 2 mostra o crescimento cromogênico dessas cinco cepas em meio sólido de celulose no dia 7.Diagramas de crescimento de diferentes cepas nas placas de ágar vermelho do Congo no dia 7. Nota: 4, 15, 31, N6 e P6 representam Colletotrichum acutatum, Nigrospora sphaerica, Exserohilum rostratum, Diaporthe phaseolorum e Pestalotiopsis arceuthobii, respectivamente.Uma árvore filogenética foi construída combinando sequências de rDNA de ITS e sequências de beta-tubulina, e os resultados (Fig. 3) mostraram que as manchas 4, 15, 31, N6 e P6 foram correlacionadas com Colletotrichum sp., Nigrospora sphaerica (CBS MH854879), Exserohilum sp., Diaporthe phaseolorum (CBS KC343176) e Pestalotiopsis sp.. Essas espécies no mesmo ramo e a similaridade é de 99–100%.Portanto, essas cinco linhagens foram identificadas como Colletotrichum sp., N. sphaerica, Exserohilum sp., D. phaseolorum e Pestalotiopsis sp., respectivamente.Uma árvore filogenética de cinco isolados deste estudo e sequências do GenBank usando ITS combinados, genes TUB2 com análise do método Neighbor-Joining é mostrada na Fig. 3. A porcentagem de árvores replicadas nas quais os táxons associados se agruparam no teste de bootstrap (1000 replicas) é mostrado acima dos ramos. A árvore é desenhada em escala, com comprimentos de ramos nas mesmas unidades que as distâncias evolutivas usadas para inferir a árvore filogenética.As distâncias evolutivas foram calculadas usando o método p-distance e estão nas unidades do número de diferenças de base persite.Todos os táxons foram distribuídos em cinco agrupamentos, sendo o filo Ascomycota em cinco ordens, cinco gêneros.A cepa P6 compôs um clado suportado, que fechou com a cepa 15. As cepas N6 e 4 compuseram um clado suportado (98% de suporte bootstrap), que fechou com as cepas P6 e 15. As sequências dessas cinco cepas foram submetidas ao banco de dados GenBank e o acesso os números obtidos (ITS e beta-tubulina) são MZ2823601/MZ964759, MZ2823600/MZ934421, MZ2823597/MZ934418, MZ2823599/MZ934420 e MZ2823598/MZ934419, respectivamente.Árvore filogenética construída com base nas sequências de ITS rDNA e beta-tubulina.Valores de bootstrap > 50% (1000 replicações) são fornecidos nos nós.Gaertneriomyces semiglobiferus foi usado como grupo externo.Como pode ser visto na Fig. 4A, o pico de produção de lacase dessas cinco cepas foi no dia 7 e começou a diminuir a partir do dia 9. A capacidade de produção de lacase das 5 cepas foi significativa (P < 0,05).Dentre eles, Pestalotiopsis sp.apresentou a maior capacidade de produção de lacase (117,66 U/mL), seguida por D. phaseolorum, N. sphaerica e Exserohilum sp.(51,82, 32,11 e 21,85 U/mL, respectivamente), e Colletotrichum sp.teve a atividade de produção de lacase mais fraca (9,76 U/mL).A ordem das atividades enzimáticas das cinco linhagens foi Pestalotiopsis sp.> D. phaseolorum > N. sphaerica > Exserohilum sp.> Colletotrichum sp.Variações das atividades enzimáticas relevantes produzidas por diferentes fungos endofíticos ao longo do tempo durante a degradação da lignina e da celulose: (A) atividade da lacase;(B) atividade da peroxidase de manganês;(C) atividade da lignina oxidase;(D) atividade de celulase.Conforme mostrado na Fig. 4B, o maior valor de produção de manganês peroxidase por Colletotrichum sp.foi de 7 dias, com atividade enzimática de 11,61 U/mL, seguida de D. phaseolorum e Exserohilum sp., com as maiores atividades enzimáticas de 8,47 e 5,58 U/mL, respectivamente.Por outro lado, N. sphaerica e Pestalotiopsis sp.apresentaram a maior capacidade de produção enzimática no dia 11, e as atividades enzimáticas foram de 8,59 e 6,79 U/mL, respectivamente.Conforme mostrado na Fig. 4C, as curvas de atividade da lignina peroxidase de D. phaseolorum, Colletotrichum sp., Exserohilum sp.todas aumentaram primeiro com a mudança do tempo, atingiram o pico da atividade enzimática e depois começaram a declinar.A maior capacidade de produção de lignina peroxidase dessas três cepas foi aos 7 dias, e as atividades enzimáticas foram 6,64, 3,0 e 2,9 U/mL, respectivamente.As atividades da lignina peroxidase de Pestalotiopsis sp.e N. sphaerica aumentou no início, depois diminuiu e então começou a aumentar novamente no dia 11, com as maiores atividades enzimáticas de 4,21 e 3,4 U/mL, respectivamente.A ordem de atividade da lignina peroxidase das cinco cepas foi D. phaseolorum > Pestalotiopsis sp.> N. sphaerica > Colletotrichum sp.> Exserohilum sp., e os valores das atividades enzimáticas nos valores mais baixo e mais alto das cinco cepas foram significativamente diferentes (P < 0,05).A partir da Fig. 4D, pode-se observar que as atividades enzimáticas de celulose das quatro cepas, Pestalotiopsis sp., D. phaseolorum, Exserohilum sp.e Colletotrichum sp.primeiro sobe até atingir um pico no dia 5 e depois declina.No entanto, para N. sphaerica, uma queda repentina é observada no dia 5 e, em seguida, um aumento no dia 7, seguido por uma diminuição.Em todas as cinco cepas, a produção de celulase no dia 7 foi mais alta.As atividades de celulase foram 1,66, 1,11, 0,67, 0,61 e 0,59 U/mL no dia 7 em Pestalotiopsis sp., D. phaseolorum, Exserohilum sp., Colletotrichum sp.e N. sphaerica, respectivamente.Como pode ser visto na Tabela 3, a pulverização diária do líquido de fermentação foi realizada nas cepas com altas enzimas de degradação da parede celular, e verificou-se que as taxas de parasitismo dessas três cepas foram todas melhoradas em graus variados, entre as quais a cepa de P. arceuthobii apresentou a melhor taxa de parasitismo, chegando a 17%, significativamente superior ao controle.Enzimas de degradação da parede celular produzidas por fungos endofíticos contribuem para o parasitismo de T. chinensis.As enzimas relacionadas à degradação da parede celular desempenham um papel importante no processo, e os fungos endofíticos são uma das fontes dessas enzimas.Portanto, neste estudo, cinco fungos endofíticos com altas enzimas de degradação da parede celular foram selecionados de 147 fungos endofíticos de ramos de Taxillus chinensis de diferentes hospedeiros.As cinco linhagens endofíticas foram Colletotrichum sp., Nigerrospora sphaerica, Exserohilum sp., Diaporthe phaseolorum e Pestalotiopsis sp., respectivamente.Ao mesmo tempo, também isolamos 47 fungos endofíticos de diferentes ramos do hospedeiro (Tabela Complementar 1).Além de Morus alba, fungos endofíticos dos outros seis hospedeiros foram sequenciados e jateados no GenBank para Colletotrichum sp., Nigerrospora sp., Diaporthe sp.e Pestalotiopsis sp.No entanto, mais pesquisas são necessárias para determinar se esses fungos também podem produzir essas enzimas de degradação da parede celular e se podem promover o parasitismo de T. chinensis.Existem muitos tipos de enzimas que degradam a parede celular.Neste estudo, quatro tipos de enzimas de degradação da parede celular foram medidos, incluindo lignina peroxidase, manganês peroxidase e lacase e celulose.Tentamos usar esses fungos endofíticos com alta produção de quatro enzimas para conduzir a cultura do caldo de fermentação e selecionamos o caldo de fermentação da linhagem com alta atividade enzimática para pulverizar sementes de T. chinensis em ramos de Morus alba todos os dias e calcular a taxa parasitária de amoreira , 5% superior ao controle (esta parte do experimento ainda é repetida de verificação e estatística).Além dessas enzimas, a análise de dados de RNA-seq publicados anteriormente mostrou que certos genes que codificam xiloglucano endoglucase/hidrolases e pectina metilesterases, poligalacturonases e enzimas semelhantes a celulase em Cuscuta campestris6,7,15,39,40.Estudos mostraram que a endoglicosilação do xiloglucano é mais evidente na parede celular da região de alargamento haustorial em direção à planta hospedeira, mas também pode ser detectada nos estágios mais avançados do desenvolvimento haustorial39.Esses dados confirmam que a invasão haustorial de espécies de Cuscuta é facilitada não apenas por ação mecânica, mas também por degradação bioquímica específica e modificação da parede celular do hospedeiro3,40.Esses pesquisadores sugerem que enzimas envolvidas na degradação e modificação da remodelação da parede celular do hospedeiro em Cuscuta XTHs preparam o parasita para a infecção do hospedeiro e podem contribuir para o crescimento haustral invasivo39.Portanto, se essas enzimas também existem no fungo dominante isolado de diferentes hospedeiros e T. chinensis, e se essas enzimas podem promover o parasitismo de haustório no hospedeiro, precisa de verificação experimental adicional.Neste estudo, o farelo de trigo foi selecionado como substrato da biomassa de fibra de lignina para fermentação, e as atividades de lacase, manganês peroxidase, lignina peroxidase e celulase foram determinadas em diferentes tempos.Verificou-se que o tempo máximo de atividade das cinco cepas produtoras de lacase e celulase foi de 7 dias, e as maiores atividades de lacase e celulase foram encontradas na cepa P6, que foram 117,66 e 1,66 U/mL, respectivamente.Pestalotiopsis sp.foi identificado por suas características morfológicas e de biologia molecular.Tem sido relatado que Pestalotiopsis sp.o fungo pode produzir atividades de lacase e celulose relativamente altas e pode efetivamente degradar o lixo florestal41.Além disso, verificou-se que a cor dos extratos do caldo de fermentação de Pestalotiopsis sp.foi significativamente mais leve do que as das outras quatro cepas.Isso ocorre porque a lacase pode ser usada com a descoloração e degradação do combustível e pode potencialmente ser usada contra estratégias de aquecimento global42,43.Pestalotiopsis sp.produziu a maior atividade de lacase de 117,66 U/mL, que foi um valor relativamente alto quando comparado às atividades de enzimas brutas não purificadas relatadas no momento, e sua produção não dependeu da adição de alguns fatores induzíveis, como temperatura do solo 80 °C, ácido ferúlico, Cu2+ ou dimetilanilina.Além disso, foi relatado por Cao et al.44 que a atividade enzimática da lacase com a adição de uma temperatura do solo de 80 °C e um indutor de Cu2+ foi de fato muito maior em uma semana de crescimento.No entanto, com exceção do fungo da podridão branca, Ganoderma applanatum, o valor médio da atividade da lacase de outros dois fungos da podridão branca (Trametes hirsuta e Fomes fomentarius) não atingiu seus valores máximos.Esses resultados indicam que Pestalotiopsis sp.é uma estirpe produtora de lacase relativamente eficaz.Os picos de atividade das peroxidases de manganês e lignina de D. phaseolorum, Colletotrichum sp., N. sphaerica e Exserohilum sp.também apareceu no dia 7, mas o segundo pico de atividades de manganês peroxidase da cepa N. sphaerica e Pestalotiopsis sp.no dia 11 foram 8,59 e 6,79 U/mL, respectivamente.As atividades enzimáticas da lignina peroxidase foram de 3,4 e 4,21 U/mL, respectivamente, que foram consistentes com os relatos de lignase e celulase de alguns fungos da podridão branca45,46,47.O segundo pico pode ser devido à liberação das enzimas intracelulares correspondentes que estavam originalmente ligadas às membranas celulares devido à autólise das hifas41.As quatro linhagens de N6, 4, 15 e 31 foram identificadas por suas características morfológicas e de biologia molecular como D. phaseolorum, Colletotrichum sp., N. sphaerica, Exserohilum sp., respectivamente.Este é o primeiro relato de quatro fungos que produzem enzimas degradantes de lignocelulose usando biomassa fibrosa de glúten de trigo como substrato.Alguns estudos anteriores também investigaram as atividades de lacase, lignina peroxidase, manganês peroxidase e celulase produzidas por fungos de seis fungos menos comuns (Alternaria sp., Penicillium sp., Cephalosporium sp., Tricherderma sp., Pestalotiopsis sp. e Aspergillus fumigates) durante a degradação da serapilheira de pinheiro Masson41.A degradação da lignina e da celulose não depende de uma única enzima, mas é o resultado das interações de várias enzimas.As enzimas de degradação da lignina consistem principalmente de três enzimas: lignina peroxidase, manganês peroxidase e lacase48.Além disso, o tamanho do círculo de cores está necessariamente relacionado ao nível de atividade da lacase, mas não há uma correlação linear positiva entre esses dois parâmetros49.As enzimas que degradam a celulose consistem principalmente de uma endoglucanase, uma exoglucanase e β-glicosidase, e a ação sinérgica dessas três enzimas é necessária para a hidrólise completa da celulose em monossacarídeos50,51,52.Em janeiro de 2020, as raízes de T. chinensis de diferentes hospedeiros, incluindo M. alba, P. salicina, P. chinense, D. odorifera, B. purpurea, D. kaki e D. longann, foram coletadas na base de plantio de T. chinensis de Cenxi Funing Village, cidade de Wuzhou (111° 51′ 14″ E, 22° 58′ 12″ N).Coletamos 3–5 haustórios de T. chinensis das mesmas plantas hospedeiras.O farelo de trigo foi adquirido da Zhonghe Modern Agricultural Development Group Co. Ltd. O pré-tratamento do farelo de trigo foi baseado no método de Tao Yanjuan53 com algumas modificações.O farelo de trigo foi triturado em peneira de malha 40, em seguida, adicionou-se 10 vezes o volume de água destilada e a mistura foi triturada em moinho coloidal por 25 min.As impurezas líquidas foram filtradas com peneira de 150 mesh e as partes sólidas foram secas em estufa a 60°C por 24 horas e depois trituradas.Dez vezes o volume de água destilada foi adicionado e aquecido a 95°C por 30 min.Utilizou-se ácido clorídrico 1 M para ajustar o pH a 5,6 e adicionou-se α-amilase resistente a altas temperaturas a 1,5% (p/p).A reação foi agitada a 95°C por 30 min, e a reação completa foi detectada com solução de iodo.A temperatura foi reduzida para 50°C e o pH foi ajustado para 9,0 com NaOH 3% (p/p) de protease alcalina foi adicionada, e a reação foi agitada por 2 h, então o sobrenadante foi descartado, filtrado e enxaguado através de um 150 -peneira de malha em água limpa até que a turbidez fosse reduzida da solução lavada, e as substâncias sólidas restantes foram secas em estufa a 60 ° C por 24 h.O farelo de trigo foi obtido por secagem e foi triturado em micromoedor, peneirado com malha 100, seco em estufa de temperatura constante a 50°C durante a noite e posteriormente armazenado.O objetivo do pré-tratamento é remover o amido e a proteína do farelo de trigo.Desta forma, o principal componente da fibra alimentar do farelo de trigo é a fibra alimentar insolúvel.O meio BDA consistiu em 200 g/L de batata, 20 g/L de glicose e 20 g/L de ágar.O pH era 7,0 e foi esterilizado a 1 × 105 Pa por 30 min.O meio líquido de semente consistia em 20 g/L de glicose, 2 g/L de extrato de levedura, 3 g/L de KH2PO4, 1,5 g/L de MgSO4·7H2O e 0,5 g/L de VB1.O pH era neutro e foi esterilizado a 1 × 105 Pa por 30 min.O meio sólido com guaiacol consistiu em 200 g/L de batata, 20 g/L de glicose, 20 g/L de ágar, 3 g/L de KH2PO4, 1,5 g/L de MgSO4·7H2O, 0,02 g/L de VB1 e 1 g/L de guaiacol.O pH era neutro e foi esterilizado a 1 × 105 Pa por 30 min.O meio básico para fermentação líquida consistiu em 30 g/L de farelo de trigo, 3 g/L KH2PO4, 1,5 g/L, MgSO4·7H2O, 1,4 g/L (NH4)2SO4, 0,3 g/L CaCl2, 5 mg/L FeSO4· 7H2O, 1,6 mg/L, MnSO4·H2O e 0,02 g/L VB1.O pH era neutro e foi dividido em frascos triangulares de 250 mL, ou 100 mL por frasco e esterilizados a 1 × 105 Pa por 30 min.O meio sólido de celulose54 consistia em 5 g/L de carboximetilcelulose de sódio, 0,5 g/L de extrato de levedura, 0,5 g/L de peptona, 0,3 g/L, extrato de carne bovina, 3 g/L, KH2PO4, 5 g/L de K2HPO4, 2 g /L, (NH4)2SO4, 0,4 g/L MgSO4, 0,1 g/L CaCl2, 1 mL de uma solução de oligoelementos, 20 g/L de pó de ágar e 0,5 g de pó vermelho do Congo dissolvido em 50 mL de água estéril.A solução de oligoelementos consistia em 0,07 g/L ZnCl2, 0,1 g/L MnCl2·4H2O, 0,06 g/L H3BO3, 0,2 g/L CoCl2·6H2O, 0,02 g/LCuCl2·2H2O, 0,02 g/L NiCl2·6H2O, 0,04 g/L NaMoO4.2H2O e 1 ml/L de ácido clorídrico.Haustório saudável e livre de doença de T. chinensis de diferentes hospedeiros foram selecionados e os tecidos foram cortados em fragmentos de 5 cm.Estas amostras foram lavadas com água da torneira e secas naturalmente.As superfícies foram sucessivamente desinfetadas com etanol 75% e HgCl2 0,1% por 2,5 min e lavadas com água estéril três vezes55.Usando fórceps e bisturis estéreis, eles foram cortados em blocos de tecido de cerca de 5 mm de tamanho e, em seguida, colocados em placas de PDA (meio contendo estreptomicina) com 5 blocos por placa e 3 placas por amostra.As culturas foram mantidas a 28°C até que o micélio crescesse a partir da borda dos blocos de tecido, e então estes foram transferidos para placas de BDA para purificação e preservação.Foi adicionado meio guaiacol PDA a 0,1% para triagem inicial de enzimas degradantes de lignina56.Após a purificação, blocos de fuangal com diâmetro de 6 mm foram selecionados e colocados nas placas em plataforma super limpa, com 3 repetições para cada cepa, e estes foram cultivados a 28°C por 10 dias.Os diâmetros das colônias e círculos de cores dentro da placa foram observados e analisados ​​estatisticamente, bem como quaisquer alterações na cor das colônias.A triagem primária de cepas de enzimas celulolíticas foi realizada pelo seguinte método.Os blocos de tecido (6 mm de diâmetro) das estirpes purificadas foram inoculados no meio de cultura juntamente com meio sólido de celulose.Para cada grupo, isso foi repetido 3 vezes e depois incubado a 28°C por 10 dias.As células foram coradas com 0,1% de vermelho do Congo por 15 min e, em seguida, descoloridas com NaCl 1 M por 15 min.Diâmetro do círculo transparente unitário = diâmetro do círculo transparente − diâmetro da colônia.Considerou-se que quanto maior o diâmetro do círculo transparente, maior a atividade de produção da enzima54.As cepas de enzimas de degradação de celulose de lignina com anéis cromogênicos e transparentes foram rastreadas de acordo com o método acima.As cepas degradantes de lignocelulose com anéis cromogênicos e transparentes foram selecionadas para culturas de 5 a 7 dias, e estas foram inoculadas quantitativamente, respectivamente.10 mL do líquido de semente agitado foram adicionados a um frasco triangular de 250 mL contendo 100 mL de meio de fermentação líquido.Cada cepa foi inoculada em 2 frascos, e 5 blocos de cepas de 6 mm de diâmetro colocados no mesmo frasco.Estes foram incubados por 11 dias em um agitador de temperatura constante a 26°C e 140 r/min.As amostras foram coletadas a partir do quarto dia de cultura líquida, uma vez ao dia.O líquido de fermentação foi filtrado com quatro camadas de gaze e o filtrado foi centrifugado a 3000 r/min por 15 min.Os sobrenadantes eram o líquido enzimático bruto.A morfologia da colônia foi registrada por referência ao método de Fang Zhongda52, e esse parâmetro foi identificado inicialmente por referência ao método de Wei Jingchao57.Seu rDNA (ITS1 5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3' e ITS4 5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3') e beta-tubulina (βT-2a) 5'-AACATGCGTGAGATTGTAAGT-3' e beta-tubulina (βT-2b) 5'-ACCTCAGTGTAGTGACCTTGGC -3') foram utilizados para identificação biológica molecular58,59.O kit Mightyamp DNA Polymerase Ver.3 (1,25U/50μL) (Takara Bio Inc., Japão, Cat. No. R076A) foi usado para selecionar hifas de fungos endofíticos como modelos para a reação de PCR.Todas as reações de PCR foram conduzidas em volumes de 50 uL contendo 1x tampão de PCR, concentrações de 0,2 mM de cada dNTP, 4 mM de MgCl2, concentrações de 0,5 uM de cada primer, 0,5 unidades de Taq DNA polimerase (Takara) e 1 uL de dez -placa de DNA (20 ng/uL).P < 0,05 foi considerado estatisticamente significativo.AnaRobô.J. Exp.Robô.Plant Physiol.Novo Fitol.J. Exp.Robô.Novo Fitol.J. Exp.Robô.Proc.NacionalAcad.Sci.AnaRobô.BMC Biotecnologia.Frente.Microbiol.Afr.J. Microbiol.Res.Novo Fitol.Afr.J. Biotechnol.Aplic.Bioquímica.Biotecnologia.J. Biosci.Bioeng.Acta Bot.Sutiãs.Viga.Mycol.PLoS Genet.Nat.Biotecnologia.Queixo.J. Biotechnol.Enzima Microb.Tecnol.Fisiol.Plantar.Tecnol.Nat.Sci.Editar.ComportamentoSci.Sci.Água Res.Biotecnologia.Aplic.Bioquímica.Aplic.Ambiente.Microbiol.Biorecurso.Tecnol.Por.Sci.Tecnol.atualOpiniãoBiotecnologia.Comp.Bioquímica.FísicaJ. Biotechnol.Mol.Biol.Evoluir33, 1870-1874 (2016).FEM Microbiol.Lett.Métodos Enzimol.Aplic.Ambiente.Microbiol.Microbiol.Acta Sci.Circun.Os autores declaram não haver interesses conflitantes.A Springer Nature permanece neutra em relação a reivindicações jurisdicionais em mapas publicados e afiliações institucionais.As imagens ou outro material de terceiros neste artigo estão incluídos na licença Creative Commons do artigo, a menos que indicado de outra forma em uma linha de crédito para o material.Se o material não estiver incluído na licença Creative Commons do artigo e seu uso pretendido não for permitido por regulamentação legal ou exceder o uso permitido, você precisará obter permissão diretamente do detentor dos direitos autorais.Qualquer pessoa com quem você compartilhar o link a seguir poderá ler este conteúdo:Desculpe, um link compartilhável não está disponível no momento para este artigo.Fornecido pela iniciativa de compartilhamento de conteúdo Springer Nature SharedIt